Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients Academic Article

journal

  • Journal of Molecular Diagnostics

abstract

  • © 2015 American Society for Investigative Pathology and the Association for Molecular Pathology.An international study was performed by 26 experienced PCR laboratories from 14 countries to assess the performance of duplex quantitative real-time PCR (qPCR) strategies on the basis of TaqMan probes for detection and quantification of parasitic loads in peripheral blood samples from Chagas disease patients. Two methods were studied: Satellite DNA (SatDNA) qPCR and kinetoplastid DNA (kDNA) qPCR. Both methods included an internal amplification control. Reportable range, analytical sensitivity, limits of detection and quantification, and precision were estimated according to international guidelines. In addition, inclusivity and exclusivity were estimated with DNA from stocks representing the different Trypanosoma cruzi discrete typing units and Trypanosoma rangeli and Leishmania spp. Both methods were challenged against 156 blood samples provided by the participant laboratories, including samples from acute and chronic patients with varied clinical findings, infected by oral route or vectorial transmission. kDNA qPCR showed better analytical sensitivity than SatDNA qPCR with limits of detection of 0.23 and 0.70 parasite equivalents/mL, respectively. Analyses of clinical samples revealed a high concordance in terms of sensitivity and parasitic loads determined by both SatDNA and kDNA qPCRs. This effort is a major step toward international validation of qPCR methods for the quantification of T. cruzi DNA in human blood samples, aiming to provide an accurate surrogate biomarker for diagnosis and treatment monitoring for patients with Chagas disease.
  • Un estudio internacional fue realizado por 26 laboratorios de PCR experimentados de 14 países para evaluar el rendimiento de las estrategias de PCR cuantitativa en tiempo real a doble cara (qPCR) sobre la base de sondas TaqMan para la detección y cuantificación de cargas parasitarias en muestras de sangre periférica de pacientes con enfermedad de Chagas. Se estudiaron dos métodos: ADN satelital (ADN satelital) qPCR y ADN kinetoplástido (ADN kDNA) qPCR. Ambos métodos incluían un control interno de amplificación. El rango reportable, la sensibilidad analítica, los límites de detección y cuantificación, y la precisión fueron estimados de acuerdo con las directrices internacionales. Además, se estimó la inclusividad y exclusividad con el ADN de las poblaciones que representaban las diferentes unidades de tipificación discreta de Trypanosoma cruzi y Trypanosoma rangeli y Leishmania spp. ambos métodos se impugnaron contra 156 muestras de sangre proporcionadas por los laboratorios participantes, incluidas muestras de pacientes agudos y crónicos con hallazgos clínicos variados, infectados por vía oral o transmisión vectorial. kDNA qPCR mostró una mejor sensibilidad analítica que SatDNA qPCR, con límites de detección de equivalentes de parásitos de 0,23 y 0,70/ml, respectivamente. Los análisis de muestras clínicas revelaron una alta concordancia en términos de sensibilidad y cargas parasitarias determinadas por las qPCRs de ADN satelital y kDNA. Este esfuerzo es un paso importante hacia la validación internacional de los métodos de qPCR para la cuantificación del ADN de T. cruzi en muestras de sangre humana, con el objetivo de proporcionar un biomarcador sustituto preciso para el seguimiento del diagnóstico y tratamiento de pacientes con la enfermedad de Chagas.

authors

publication date

  • 2015/1/1

keywords

  • Biomarkers
  • Chagas Disease
  • DNA
  • Guidelines
  • Leishmania
  • Limit of Detection
  • Molecular Pathology
  • Parasite Load
  • Parasites
  • Physiologic Monitoring
  • Polymerase Chain Reaction
  • Real-Time Polymerase Chain Reaction
  • Satellite DNA
  • T-DNA
  • Therapeutics
  • Trypanosoma cruzi
  • Trypanosoma rangeli

International Standard Serial Number (ISSN)

  • 1525-1578

number of pages

  • 11

start page

  • 605

end page

  • 615