Introducción Los cálculos biliares que se forman y crecen en la vesícula biliar a menudo provocan enfermedades o, en última instancia, requieren la extirpación quirúrgica de la vesícula biliar (colecistectomía). Las etiologías de la formación de cálculos biliares no se comprenden por completo, especialmente cuando se sospecha que existen funciones causales o vías de inflamación o microbiota bacteriana. Los estudios previos sobre el microbioma y la biota biliar se han realizado principalmente en un solo sitio y no han resuelto estas cuestiones; también es posible que se haya subestimado la confusión con bacterias exógenas o ADN bacteriano (“contaminoma“).Métodos Se obtuvieron muestras de bilis de vesícula biliar, cálculos biliares, tejido de vesícula biliar, placa subgingival y heces de 51 pacientes, así como un blanco de extracción de ADN, en el momento de la cirugía de colecistectomía electiva en el Hospital Universitario Mederí en Bogotá, Colombia. Se realizó la secuenciación Illumina MiSeq de los 5 sitios biológicos, así como el blanco de extracción de ADN, para cada paciente. También se incluyeron controles rigurosos para identificar la contribución de la contaminación postoperatoria por bacterias/ADN bacteriano de laboratorios, equipos o kits de reactivos. Las secuencias de lectura de ADNr V4 16S de extremos apareados se analizaron utilizando (a) un protocolo de agrupamiento estándar (mothur) y (b) un protocolo de procesamiento de secuencia personalizado de máxima resolución (radio cero/zOTU).Resultados Comparamos las frecuencias bacterianas en cinco sitios biológicos y un control de extracción de ADN para cada uno de los 51 pacientes, y analizamos individualmente cada tipo de secuencia bacteriana que tenía una abundancia por encima de un límite definido globalmente. Pseudomonas y Flavobacterium se identificaron como contaminantes dominantes, como se informa a menudo. Se determinó que una parte significativa de las muestras de bilis tenían baja biomasa (menos de 104 UFC de bacterias/ml de bilis). La visualización de las matrices de frecuencia de 6x51 de las secuencias exactas (sitios x pacientes) permitió el reconocimiento basado en contraste de patrones consistentes de bacterias biliares en los pacientes (frecuencias en bilis vs. cálculo biliar vs. tejido). Diez pacientes exhibieron altos recuentos generales de bacterias viables en bilis (como se infirió de forma independiente a través de secuencias), lo que permitió la comparación con los registros clínicos y la identificación de modelos compatibles de formación/etiología de cálculos biliares. También en otros pacientes, los tipos de secuencia bacteriana más abundantes a menudo se pudieron identificar de manera confiable como originarios de sitios biliares.Conclusiones Nuestro hallazgo de que una quinta parte de la cohorte tenía infecciones o una marcada presencia bacteriana en la bilis concuerda con los porcentajes informados previamente. Los hallazgos basados en secuencias y experimentales de niveles generalmente bajos de bacterias biliares viables incluso en muchos pacientes con cálculos biliares son compatibles con la noción de que las bacterias son raras o están ausentes en individuos sanos. Algunas bacterias abundantes que fueron reconocidas confiablemente como de origen biliar pudieron rastrearse en toda la cohorte. El diseño/métodos y los resultados presentados aquí, incluidos los controles extensos, pueden ayudar a futuros estudios que investiguen los roles de las bacterias en las etiologías de los cálculos biliares.
Introduction Gallstones that form and grow in the gallbladder often lead to disease or ultimately require surgical removal of the gallbladder (cholecystectomy). Aetiologies of gallstone formation are not completely understood, especially where causal roles or routes of inflammation and/or bacterial microbiota are suspected. Previous biliary microbiome/biota studies have been mostly single-site and have not resolved such questions; confounding with exogenous bacteria or bacterial DNA (‘contaminome’) may also have been underestimated.Methods Samples from gallbladdder bile, gallstones, gallbladder tissue, subgingival plaque and faeces were obtained from 51 patients as well as a DNA extraction blank, at the time of elective cholecystectomy surgery at the Mederí University Hospital in Bogotá, Colombia. Illumina MiSeq sequencing was carried out from the 5 biological sites, as well as the DNA extraction blank, for each patient. Rigorous controls were also included to identify contribution of post-operation contamination by bacteria/bacterial DNA from laboratories, equipment or reagent kits. The paired-end V4 16S rDNA read sequences were analysed using (a) a standard clustering protocol (mothur), and (b) a custom highest-resolution (zero-radius/zOTU) sequence processing protocol.Results We compared bacterial frequencies at five biological sites and a DNA extraction control for each of the 51 patients, and individually analysed each bacterial sequence-type having an abundance above a globally defined cutoff. Pseudomonas and Flavobacterium were identified as dominant contaminants, as is often reported. A significant portion of the bile samples were determined to be low biomass (less than 104 CFU bacteria/mL bile). Viewing of exact sequences’ 6x51 frequency matrices (sites x patients) allowed contrast-based recognition of consistent patterns of biliary bacteria in patients (frequencies in bile vs gallstone vs tissue). Ten patients exhibited high overall viable bacterial counts in bile (as inferred independently via sequences), allowing comparison with clinical records and identification of compatible gallstone formation/aetiology models. Also in other patients, more abundant bacterial sequence-types could often be reliably identified as originating from biliary sites.Conclusions Our finding that a fifth of the cohort had infections or marked bacterial presence in bile agrees with previously reported percentages. The sequence-based and experimental findings of generally low levels of viable biliary bacteria even in many gallstone patients is compatible with a notion that bacteria are rare or absent in healthy individuals. Some abundant bacteria that were reliably recognised as having biliary origins could be tracked across the cohort. The design/methods and results presented here, including the extensive controls, may aid future studies investigating roles of bacteria in gallstone aetiologies.
