Resumen
- Cryptococcus neoformans, an opportunistic fungal pathogen ubiquitously present in the environment, causes cryptococcal meningitis (CM) mainly in immunocompromised patients, such as AIDS patients. We aimed to identify disease-associated cryptococcal protein antigens targeted by the human humoral immune response. Therefore, we used sera from Colombian CM patients, with or without HIV infection, and from healthy individuals living in the same region. Serological analysis revealed increased titers of anti-cryptococcal IgG in HIV-negative CM patients, but not HIV-positive CM patients, compared to healthy controls. In contrast, titers of anti-cryptococcal IgM were not affected by CM. Furthermore, we detected pre-existing IgG and IgM antibodies even in sera from healthy individuals. The observed induction of anti-cryptococcal IgG but not IgM during CM was supported by analysis of sera from C. neoformans-infected mice. Stronger increase in IgG was found in wild type mice with high lung fungal burden compared to IL-4Rα-deficient mice showing low lung fungal burden. To identify the proteins targeted by human anti-cryptococcal IgG antibodies, we applied a quantitative 2D immunoproteome approach identifying cryptococcal protein spots preferentially recognized by sera from CM patients or healthy individuals followed by mass spectrometry analysis. Twenty-three cryptococcal proteins were recombinantly expressed and confirmed to be immunoreactive with human sera. Fourteen of them were newly described as immunoreactive proteins. Twelve proteins were classified as disease-associated antigens, based on significantly stronger immunoreactivity with sera from CM patients compared to healthy individuals. The proteins identified in our screen significantly expand the pool of cryptococcal proteins with potential for (i) development of novel anti-cryptococcal agents based on implications in cryptococcal virulence or survival, or (ii) development of an anti-cryptococcal vaccine, as several candidates lack homology to human proteins and are localized extracellularly. Furthermore, this study defines pre-existing anti-cryptococcal immunoreactivity in healthy individuals at a molecular level, identifying target antigens recognized by sera from healthy control persons.
- Cryptococcus neoformans, un patógeno fúngico oportunista presente en todas partes en el medio ambiente, causa meningitis criptocócica (CM) principalmente en pacientes inmunocomprometidos, como los pacientes con SIDA. Nuestro objetivo era identificar antígenos proteicos criptocócicos asociados a enfermedades a los que se dirige la respuesta inmunitaria humoral humana. Por lo tanto, utilizamos sueros de pacientes colombianos con CM, con o sin infección por VIH, y de individuos sanos que viven en la misma región. El análisis serológico reveló títulos elevados de IgG anticriptocócica en pacientes con CM VIH negativos, pero no en pacientes con CM VIH positivos, en comparación con los controles sanos. Por el contrario, los títulos de IgM anticriptocócica no se vieron afectados por la CM. Además, detectamos anticuerpos IgG e IgM preexistentes incluso en sueros de individuos sanos. La inducción observada de IgG anticriptocócica pero no de IgM durante la CM fue respaldada por el análisis de sueros de ratones infectados con C. neoformans. Se encontró un mayor aumento de IgG en ratones de tipo salvaje con una alta carga fúngica pulmonar en comparación con ratones con deficiencia de IL-4Rα que mostraban una baja carga fúngica pulmonar. Para identificar las proteínas a las que se dirigen los anticuerpos IgG anticriptocócicos humanos, aplicamos un enfoque cuantitativo de inmunoproteoma 2D que identifica manchas de proteínas criptocócicas reconocidas preferentemente por sueros de pacientes con CM o individuos sanos, seguido de un análisis de espectrometría de masas. Se expresaron de forma recombinante veintitrés proteínas criptocócicas y se confirmó que eran inmunorreactivas con sueros humanos. Catorce de ellas fueron descritas recientemente como proteínas inmunorreactivas. Doce proteínas se clasificaron como antígenos asociados a enfermedades, basándose en una inmunorreactividad significativamente más fuerte con sueros de pacientes con CM en comparación con individuos sanos. Las proteínas identificadas en nuestra evaluación amplían significativamente el conjunto de proteínas criptocócicas con potencial para (i) el desarrollo de nuevos agentes anticriptocócicos basados en implicaciones en la virulencia o supervivencia de los criptococos, o (ii) el desarrollo de una vacuna anticriptocócicas, como varios candidatos. Carecen de homología con las proteínas humanas y se localizan extracelularmente. Además, este estudio define la inmunorreactividad anticriptocócica preexistente en individuos sanos a nivel molecular, identificando antígenos diana reconocidos por sueros de personas de control sanas.